国家重大科学研究计划项目“生物医学纳米材料对血细胞作用的研究”工作进展与讨论

结合多模态纳米探针进行淋巴癌等血液恶性肿瘤的在体分子成像与疗效评价研究

东南大学 顾宁 教授


1. 外场诱导的诊断和治疗微气泡的研究

现代医学的进步既要求疗效更好的治疗药物的开发,也要求能够在治疗疾病的同时能够进行有效的诊断。近年来,为了达到更好的控制释放诊断和治疗成分,外场激发的控制释放方式获得了广泛的研究,这些外界控制方式包括微波、声学、激光、电场、磁场以及体内的生化过程诱导,如体内温度、pH值变化等。该实验主要研究了交变磁场诱导作为微囊内包裹成分进行控制释放的可能性。实验首先制备了膜壳装载超顺磁性Fe3O4纳米颗粒,内部包裹L-精氨酸的聚合物微囊,然后利用膜壳中Fe3O4纳米颗粒对外界交变磁场的响应从而能够引起微囊膜壳渗透性等性质的改变而进行微囊内外物质的交换,使膜壳内的精氨酸和膜壳外的H2O2接触,产生NO气体,一方面可用于超声显影增强用造影剂,另一方面也可用于心血管疾病治疗用的治疗药物。
Fang Yang, Ping Chen, Wen He, Ning Gu, Xizhi Zhang, Kun Fang, Yu Zhang, JianFei Sun, Jiayi Tong. Bubble Microreactors Triggered by an Alternating Magnetic Field as Diagnostic and Therapeutic Delivery Devices. Small, 2010, 6(12): 1300–1305.


Figure 1 Magnetization curves of the naked Fe3O4 nanoparticles and Fe3O4-inclusion microcapsules at room temperature.


Figure 2 Morphology of Fe3O4-inclusion microcapsules: (a, c) Optical microscopy and SEM images before alternating magnetic field treatment; (b, d) Optical microscopy and SEM images immediately after alternating magnetic field treatment; (e) SEM image of the damaged microreactors after further ultrasonic exposure.


Figure 3 The in vitro ultrasound images of the different samples: (a) de-gassed and de-ionized water; (b) the microcontainer solution before alternating magnetic field treatment; (c, d) the microcontainer solution after alternating magnetic field treatment when US imaging lasted for 2min and 10min respectively; (e) After magnetic field treatment, the US images of mean grey scale change curve were captured. The enhancement of the ultrasound imaging was changed over the time.

2. EGFR单抗偶联类酶磁性纳米粒子的纳米探针

构建了EGFR单抗偶联类酶磁性纳米粒子的纳米探针,并针对临床EGFR过表达的表皮鳞癌(食管癌)组织进行免疫组化检测,成功实现了对癌组织细胞膜的清晰染色。收集2009年6月至2010年7月,共35例(初次手术、未接受过放化疗,手术切除标本,病理证实为食管鳞癌、有明确的病史资料数据、蜡块足够切5片以上切片者)石蜡包埋病理切片,利用构建的纳米探针进行免疫组化检测,获得了与传统基于HRP酶标抗体的免疫组化方法类似的结果,检测得到EGFR在食管癌组织中表达率分别为57.1%和48.6%;两种方法的等级资料R检验、Spearman等级相关检验、灵敏度、特异度、约登指数、阳性预测值、阴性预测值、粗一致性等均提示两种方法具有良好的相关性。部分研究结果已经被Nanotechnology录用。
Yihang Wu, Mengjie Song, Zhuang Xin, Xiaoqing Zhang, Yu Zhang, Chunyu Wang, Suyi Li and Ning Gu, Ultra-small Particles of Iron Oxide as Peroxidase for Immunohistochemical Detection, Nanotechnology, accepted.


Figure 4. 磁性纳米探针构建及用于EGFR检测的示意图


Figure 5. 免疫组化检测结果,由于癌组织细胞膜过表达EGFR,而被清晰染色(棕色)

3. 树枝状大分子与肺泡作用的分子动力学模拟

我们构造了PAMAM dendrimer(一种较广泛应用于生物医学相关领域的“明星”纳米材料)与模型肺表面活性剂相互作用的仿真模型,运用分子动力学模拟研究了随空气进入肺泡的电中性PAMAM dendrimer与模型肺表面活性剂的相互作用过程。我们首先考察了呼气过程,研究表明不同代(G3,G5,G7)的电中性PAMAM dendrimer对模型肺表面活性剂的影响差异较大。G3 PAMAM dendrimer对模型肺表面活性剂的影响较小,G5、G7则促使模型肺表面活性剂产生较大形变的结构并且抑制气液界面上的表面活性剂分子在呼气过程中的正常相变。肺表面活性剂相关的模拟工作提供分子层面上的结构和动力学信息,可促进肺表面活性剂结构和功能缺失相关疾病的机理解释。相关工作发表在Soft Matter (2011)上。
Xubo Lin, Yang Li, Ning Gu. Molecular dynamics simulations of the interactions of charge-neutral PAMAM dendrimers with pulmonary surfactant. Soft Matter, 2011, DOI: 10.1039/C0SM01382J


Figure 6. 电中性PAMAM dendrimer与肺表面活性剂的分子动力学研究

4. 眼表粘膜接种纳米为载体的DNA疫苗复合物研究部分

添加了修饰剂PEI后,纳米复合物体外结合DNA的能力明显增强,表明此复合物有较好的携带DNA的能力,是基因的良好输送载体。PEI- Fe3O4复合物能有效防止DNA酶的降解,从而保护DNA,使DNA疫苗不被体内酶降解,从而有效地发挥其作用。纳米复合物载体明显增强了DNA疫苗的转化率,提高了目的基因的表达。细胞毒性检测实验表明,PEI- Fe3O4 DNA复合物对哺乳动物细胞基本无毒性,其生存率近似于阴性对照。PEI- Fe3O4- pRSC-gD-IL-21复合物转染哺乳动物细胞后,目的蛋白可成功表达,且其效率不低于脂质体转染。纳米复合物增强了疫苗可诱导特异性细胞免疫应答及非特异性固有免疫应答。

可见,眼表粘膜接种(局部滴眼)纳米为载体的DNA疫苗复合物PEI- Fe3O4-pRSC-gD-IL-21在小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)动物模型中显示出能诱导明显较强的特异性的细胞、体液免疫应答以及粘膜免疫应答,并明显抵抗了单纯疱疹病毒(HSV)-1型的眼部感染及减轻了HSK的发生、发展。我们的以上研究为今后此疫苗进一步的临床开发奠定了坚实的基础。
Kai Hua,Jun Dou,Fangliu,Xiangfeng H,Xianwen Yuan,Yaqing Wang,Chunsheng Liu,Ning Gu.An ocular mucosal administration of nanoparticles containing DNA vaccine pRSC-gD-IL-21 confers protection against mucosal challenge with herpes simplex virus type 1 in mice. Vaccine, 2011 Feb 4;29(7):1455-62.


Figure 6. 各组鼠被HSV-1攻击后角膜结膜病理图(第15天,HE,×200) A:正常 B:pRSC-gD-IL-21 +nanoparticles C:pRSC-gD-IL-21 D:pRSC-gD E: pRSC 上层:A:角膜基质(箭头指示,以下同)未见炎性细胞浸润;B: 极少量炎性细胞浸润。C: 炎性细胞浸润增多;D: 较多炎性细胞密集浸润。E: 大量炎性细胞浸润,充满整个基质层。 下层:A:结膜下组织(箭头指示,以下同)未见炎性细胞浸润;B:极少炎性细胞浸润。C: 炎性细胞浸润增多,并有局部出血;D: 较多密集炎性细胞浸润。e: 结膜结构明显紊乱,大量炎性细胞浸润。