国家重大科学研究计划项目“生物医学纳米材料对血细胞作用的研究”工作进展与讨论

基于纳米材料的白血病病因和病理学研究

苏州大学 赵昀 博士


我们子项目一在过去的4个月里,经过紧张的探索和尝试,取得了一定的进展。现由该子项目一的负责人,苏州大学的尹斌教授,将详细内容汇报如下(2011-9-3):

课题一、多壁纳米碳管对白血病病毒诱导小鼠白血病过程的影响

【由苏州大学尹斌教授课题组的郑彦文完成】

白血病(Leukemia)是最为常见的血液系统恶性肿瘤,其病理机制尚不明了,临床症状呈现高度异质性,诊断复杂,治愈率低下。因此,阐明白血病发病机制,改进白血病的疗法是当前医学领域中的一项重要工作。研究表明murine leukemia virus (MuLV) 多效逆转录病毒,可以诱导淋巴性(T- and B-cell)和非淋巴性白血病(myeloid, erythroid, megakaryocytic)。近交系C57BL/6小鼠对白血病因子较敏感,可以作为逆转录病毒诱导的白血病模型。纳米技术在材料学与生物学领域的应用不断创新和突破,如支撑和导向神经修复、细胞标记、基因与药物的递送等。那么,当纳米材料作为药物,进入白血病患者体内,是否会与血液细胞相互作用,进而改变恶性肿瘤的进程或状态,有待于深入探索。本实验旨在通过Mol4070LTR病毒感染方法,建立小鼠白血病模型,研究MuLV的致病机制,并初步探索纳米材料在疾病进程中的治疗作用。

思路:


图1:多壁纳米碳管对白血病病毒诱导小鼠白血病过程的影响研究思路

初步结果:

研究表明新生B6小鼠在注射Mol4070LTR病毒3个月后,表现为濒死症状:蜷缩、发抖,毛发不齐整等发病、继而死亡。小鼠濒死前,解剖发现:四肢淋巴结有肿大现象,打开腹腔膜,发现里面的脏器都明显肿大(肝脏、脾脏、肾脏),尤其是胸腺有明显的肿大,成一团白色的物质,将肺压迫在胸腔最底层。(图2)


图2:C57BL/6J小鼠注射未浓缩MoL4070LTR/NIH3T3,3个月后发病,解剖图示。

课题二、量子点在白血病研究中的应用初探

【由苏州大学尹斌教授课题组的郑彦文完成】

纳米材料量子点为荧光标记物,用于活细胞示踪观察。利用载体与量子点形成稳定的复合物,该复合物可以通过胞吞作用进入细胞,可随细胞有丝分裂进入子细胞,达到较为稳定的细胞示踪效果,应用于干细胞分化、细胞形态、细胞动力学、细胞融合、细胞迁移等细胞功能的研究。本实验旨在检测荧光量子点对常见白血病细胞、骨髓细胞及贴壁293t细胞的标记效果。初步结果显示QD对于不同的细胞标记效率不同。

初步实验设计:


结果:

孵育1h后,用蔡司荧光显微镜,紫外激发观察,标记结果见表2及图1.



图1:QD+TAT标记三种细胞1h后,观察结果,A:32D: 400×,B:293T: 400×,C: HL-60: 200× (QDs+TAT: 10nM)

课题三、利用纳米磁铁颗粒结合PCR方法分离基因组的原病毒插入位点

【由苏州大学尹斌教授课题组的徐中娟完成】

在这种PCR方法中利用纳米磁珠对DNA片段进行纯化,增强条带特异性和电泳背景的清晰度。在实验初期,本着节约科研资金、简化实验步骤的原则,对实验系统进行了一系列的探索。下面是改变实验中的酶切体系和聚合酶得到的结果。

1.


2. 取BXH-2系小鼠中不同类型的细胞进行相同SplinkBlunt-PCR操作,可以得到一条比较一致的胚系条带。进一步证明了这种体系替换的可行性。


课题四、中枢神经系统性白血病的形成机制的研究

【由苏州大学陈子兴教授课题组的冯洒然完成】

陈子兴教授课题组的研究发现,白血病细胞可以分泌基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9,破坏细胞间的紧密连接,从而增加血脑屏障的通透性。该项重要发现,揭示了中枢神经系统性白血病的形成机制,已发表在今年的PloS ONE杂志上。
Feng Saran, Cen Jinanong, Huang Yihong, Shen Honhjie, Yao li, Wang Yuayuan, Chen Zixing. Matrix metalloproteinase-2 and -9 secreted by leukemic cells increase the permeability of blood-brain barrier by disrrupting tight junction proteins. PloS ONE 2011;6(8):e20599

[Abstract:Central nervous system (CNS) involvement remains an important cause of morbidity and mortality in acute leukemia, the mechanisms of leukemic cell infiltration into the CNS have not yet been elucidated. The blood-brain barrier (BBB) makes CNS become a refugee to leukemic cells and serves as a resource of cells that seed extraneural sites. How can the leukemic cells disrupt this barrier and invasive the CNS, even if many of the currently available chemotherapies can not cross the BBB? Tight junction in endothelial cells occupies a central role in the function of the BBB. Except the well known role of degrading extracellular matrix in metastasis of cancer cells, here we show matrix metalloproteinase (MMP)-2 and -9, secreted by leukemic cells, mediate the BBB opening by disrupting tight junction proteins in the CNS leukemia. We demonstrated that leukemic cells impaired tight junction proteins ZO-1, claudin-5 and occludin resulting in increased permeability of the BBB. However, these alterations reduced when MMP-2 and -9 activities were inhibited by RNA interference strategy or by MMP inhibitor GM6001 in an in vitro BBB model. We also found that the disruption of the BBB in company with the downregulation of ZO-1, claudin-5 and occludin and the up-regulation of MMP-2 and -9 in mouse brain tissues with leukemic cell infiltration by confocal imaging and the assay of in situ gelatin zymography. Besides, GM6001 protected all mice against CNS leukemia. Our findings suggest that the degradation of tight junction proteins ZO-1, claudin-5 and occludin by MMP-2 and -9 secreted by leukemic cells constitutes an important mechanism in the BBB breakdown which contributes to the invasion of leukemic cells to the CNS in acute leukemia.]

其它的相关研究正在进行中。