国家重大科学研究计划项目“生物医学纳米材料对血细胞作用的研究”工作进展与讨论

生物纳米探针对血液恶性肿瘤细胞的体外作用与检测研究

南京大学 朱俊杰 教授


一、银纳米粒子-磷酸钛空心球复合材料的合成及其用作标记物在超灵敏电化学免疫分析中的应用

人白介素6 ( IL-6) 是一个具有广泛生物学活性的细胞因子, 它的异常表达在多发性骨髓瘤及白血病的发生、发展中起重要作用。有研究发现白血病患者血浆IL-6 水平均明显升高,而病情缓解后IL-6水平下降,表明IL-6可能成为判断白血病的预后因子之一。因此,及早、灵敏检测出白血病人血浆中的白介素6的含量具有很重要的临床价值。本工作合成了一种银纳米粒子-磷酸钛空心球(AgNPs-TiP)复合材料,并与蛋白质抗体结合,用作复合探针对IL-6进行了电化学免疫分析。首先,通过模板法合成了直径为430 nm,壳层厚度为40 nm的磷酸钛空心球。通过离子交换作用,银纳米粒子可以原位负载到磷酸钛壳中,从而制备了银纳米粒子-磷酸钛空心球复合材料。这种复合材料具有良好的生物相容性、分散性及很高的银负载量,因此有望成为一种生物分子的固定载体。本工作中,该复合材料与抗体分子结合,形成Ab2-AgNPs-TiP探针用于电化学免疫分析。这种免疫传感器对人细胞因子检测具有很高的灵敏度。其主要是因为大量的银纳米粒子的负载使得其电化学检测信号放大。另外,由于在免疫分析中采用了磁性分离,从而减少了非特异性吸附。AgNPs-TiP 复合材料有望在其它生物分析体系及胶囊制备、药物负载等领域得到应用。


Scheme 1. Schematic illustration of the fabrication process of Ab2-AgNPs-TiP bioconjugates: (A) PS@TiP core-shell sphere; (B) hollow TiP sphere; (C) AgNPs-TiP hybrid; (D) Ab2-AgNPs-TiP bioconjugates


Scheme 2. Schematic illustration of electrochemical immunoassay of IL-6: (A) magnetic sensing array; (B) immunoreaction; (c) sandwiched immunoassay of IL-6 using Ab2-AgNPs-TiP bioconjugates; (D) release of silver ions by the reaction with acid; (E) DPV signal of the immunoassay.


Figure 1. a) Low and b) high magnification TEM images of hollow TiP spheres. c) low and d) high magnification TEM images of AgNPs-TiP hybrids.


Figure 2. A) Typical differential pulse voltammetry of electrochemical immunoassay by Ab2-AgNPs-TiP labels with increasing IL-6 concentration from (a) to (g) (0.0005, 0.001, 0.01, 0.1, 0.2, 1.0, and 10 ng mL-1 IL-6, respectively). B) The resulting calibration curve of IL-6 plotted on a semi-log scale.

二、辣根过氧化酶功能化的纳米粒子用于血液细胞表面DR4/DR5的电化学检测

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族成员之一,能选择性诱导多种细胞系的凋亡,而对正常细胞没有作用。TRAIL分别于DR4和DR5受体结合,导致TRAIL三聚体化,被激活的TRAIL募集接头分子FADD,则通过它的死亡效应结构( DED )与细胞内的procaspase结合, 形成死亡诱导信号复合物(DISC),后者刺激Caspase 8和Caspase 10的活化,Caspase 8活化后能够引发Caspase蛋白酶级联反应, 最后激活其效应物Caspase 3发挥生物学功能。经文献调研发现,死亡受体在肿瘤细胞中的表达远远多于正常细胞,而且与肿瘤进展相关,这种相关具有肿瘤组织特异性。本工作基于四氧化三铁磁性微球为载体的多酶放大技术构建了一种新型的电化学细胞传感器用于细胞表面DR4/DR5的超灵敏检测。通过树枝状大分子(PAMAM)以及将高比例的辣根过氧化酶/肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(HRP/TRAIL)负载于Fe3O4表面,从而达到双重信号放大的作用。为了构建传感器基底,我们将碳氮纳米管(PDCNx)以及树枝状分子稳定的金胶(Au DSNPs)组装到电极表面,用于适配体(KH1C12)的固定。利用KH1C12特异性识别并结合HL-60细胞将细胞捕获到传感器界面上,并进一步结合TRAIL纳米探针,在过氧化氢存在下,通过还原被过氧化氢氧化的硫瑾而产生的电化学信号随着DR4/DR5表达的增加而提高。这种方法快速,灵敏度高,选择性好,在DR4/DR5的检测中有着潜在的应用价值。


Scheme 1. Schematic illustration of electrochemical immunoassay of DR4/DR5.