国家重大科学研究计划项目“生物医学纳米材料对血细胞作用的研究”工作进展与讨论

基于纳米材料的白血病病因和病理学研究

苏州大学 尹斌 教授


鉴定白血病基因Bcl11a的新的转录起始位点
徐中娟,尹甲伟,尹斌
苏州大学 唐仲英血液学研究中心

研究背景:

Bcl11a基因(B-cell leukemia 11A gene),又名Evi9或CTTP1,参与基因转录调控,主要表达于胎脑、脾、睾丸、B细胞和树枝状细胞,该基因已经被证明参与诱发白血病,可能作为白血病分子治疗的新靶标,为深入开展Bcl11a的基础和临床研究奠定了一块基石。Bcl11a在白血病发生发展中的相关研究甚为贫乏。

本项目拟通过分子水平、细胞水平及临床标本的分析,深入研究Bcl11a基因的启动子以及其在引发白血病过程中调控其表达的上游重要的反式作用因子,了解Bcl11a的生物学基础和Bcl11a异常所致疾病的机制,进一步理解Bcl11a在白血病发生、发展中所起的作用,有助于寻找更好的分子标靶来合理地设计药物,以期达到对白血病更有效的治疗,实现医学转化。尤其是近来的一些研究提示,Bcl11a还可能参与其它重要的病理过程。因而,本项目具有重要的理论意义和可能的临床价值。

为了鉴定基因的启动子,首先我们有必要找到Bcl11a的转录起始位点。目前,RACE(rapid amplification of cDNA ends)仍然是寻找转录起始位点的主要方法,具有简单、快速、廉价等优势,以mRNA为模板反转录成cDNA第一条链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3’或5’端之间未知序列,相应地,也因此而有3’-RACE和5’-RACE之分。总所周知,RACE的原理虽然简单,但是实际成功率并不高。我们课题组在前期研究中,发现采用纳米磁铁颗粒可以明显提高LM-PCR的效能。本项工作在此期研究的基础上,采用纳米磁铁分离技术,结合5’RACE,鉴定Bcl11a的转录起始位点。

我们先通过生物信息学分析,发现NCBI公布的人BCL11A转录起始位点(+1)上游1500bp可能含有启动子序列,将该1500bp通过TRANSFAC数据库(Gene Regulation)检索分析后得出下图1,并发现了一些有意思的反式作用因子如GATA-1,C/EBPalp等。


图1. 人Bcl11a启动子序列分析示意图

实验设计思路:

为了验证NCBI公布的转录起始位点是否为BCL11A正确的转录起始位点,我们采用纳米磁铁分离技术,进行了5’RACE实验,同时为了排除基因组DNA污染的可能,我们通过RT-PCR进行验证。


图2. 引物设计示意图


图3. 5’RACE技术流程示意图

实验操作流程:


实验结果:

在RACE操作中,对200bp和350bp左右的电泳条带进行回收、测序发现:一条带得到的转录起始位点与NCBI上公布的一致,另一条带得到的序列在原位置上还向前延伸了140bp左右。(见图4)

为了排除基因组DNA污染,我们在RACE验证基础上设计如图2一对引物,上游引物3位于5’-RACE延伸的末端,下游引物4位于BCL11A外显子2上面。根据PT-PCR扩增得到的条带长度判断模板cDNA里面是否含有基因组DNA。若外显子1和2之间没有内含子,扩增得到的条带约为470bp;若含有内含子,则条带远大于470bp。实验结果表明,以THP-1的cDNA为模板,扩增得到一个约470bp的片段(见图5),经过测序之后发现该片段由设计的引物扩增出。排除了BCL11A外显子1和外显子2之间存在内含子的可能,即排除了基因组DNA的干扰,同时也验证了RACE的结果。


图4. RACE鉴定电泳结果


图5. RT-PCR鉴定电泳结果

结论:

在此项研究工作中,我们证明了人白血病基因BCL11A的转录起始位点,可能在NCBI公布的转录起始位点基础上还要向前延伸约140bp。