国家重大科学研究计划项目“生物医学纳米材料对血细胞作用的研究”工作进展与讨论

基于纳米材料的白血病病因和病理学研究

苏州大学 尹斌 教授


我们课题一在过去的4个月里,经过紧张的探索和尝试,取得了一定的进展。现将详细内容汇报如下(2013-1-1):

1 5’ RACE法鉴定白血病基因Bcl11a的转录起始位点(徐中娟,尹甲伟)

Bcl11a基因(B-cell leukemia 11A gene),又名Evi9或CTTP1,参与基因转录调控,主要表达于胎脑、脾、睾丸、B细胞和树枝状细胞,该基因已经被证明参与诱发白血病,可能作为白血病分子治疗的新靶标,为深入开展Bcl11a的基础和临床研究奠定了一块基石。

本项目拟通过分子水平、细胞水平及临床标本的分析,深入研究Bcl11a基因的启动子以及其在引发白血病过程中调控其表达的上游重要的反式作用因子,了解Bcl11a的生物学基础和Bcl11a异常所致疾病的机制,进一步理解Bcl11a在白血病发生、发展中所起的作用,有助于寻找更好的分子标靶来合理地设计药物,以期达到对白血病更有效的治疗,实现医学转化。尤其是近来的一些研究提示,Bcl11a还可能参与其它重要的病理过程。因而,本项目具有重要的理论意义和可能的临床价值。

为了鉴定基因的启动子,首先我们有必要找到Bcl11a的转录起始位点。目前,RACE(rapid amplification of cDNA ends)仍然是寻找转录起始位点的有效方法,具有简单、快速、廉价等优势,以mRNA为模板反转录成cDNA第一条链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3’或5’端之间未知序列,相应地,也因此而有3’-RACE和5’-RACE之分。本项工作中,采用纳米磁铁分离技术,结合5’RACE,鉴定Bcl11a的转录起始位点。

NCBI公布的人BCL11A转录起始位点(+1)上游1500 bp可能含有启动子序列,将该1500 bp通过TRANSFAC数据库(Gene Regulation)检索分析后得出下图1,并发现了一些有意思的反式作用因子如GATA-1,C/EBPalp等。


图1. 人BCL11A启动子序列分析示意图

实验设计思路:

为了验证NCBI公布的转录起始位点是否为BCL11A正确的转录起始位点,我们采用纳米磁铁分离技术,进行了5’RACE实验,同时为了排除基因组DNA污染的可能,我们通过RT-PCR进行验证。


图2. 引物设计示意图


图3. 5’RACE技术流程示意图

实验操作流程:


实验结果:

在RACE操作中,对200 bp和350 bp左右的电泳条带进行回收、测序发现:一条带得到的转录起始位点与NCBI上公布的一致,另一条带得到的序列在原位置上还向前延伸了140 bp左右(见图4)。

为了排除基因组DNA污染,我们在RACE验证基础上设计如图2一对引物,上游引物3位于5’-RACE延伸的末端,下游引物4位于BCL11A外显子2上面。根据PT-PCR扩增得到的条带长度判断模板cDNA里面是否含有基因组DNA。若外显子1和2之间没有内含子,扩增得到的条带约为470 bp;若含有内含子,则条带远大于470 bp。实验结果表明,以THP-1的cDNA为模板,扩增得到一个约470 bp的片段(见图5),经过测序之后发现该片段由设计的引物扩增出。排除了BCL11A外显子1和外显子2之间存在内含子的可能,即排除了基因组DNA的干扰,同时也验证了RACE的结果。


图4. RACE鉴定电泳结果


图5. RT-PCR鉴定电泳结果

结论:

在此实验中我们证明了人白血病基因BCL11A的转录起始位点可能在NCBI公布的转录起始位点基础上还要向前延伸约140 bp。

2 PIS-PCR方法分离白血病病毒MOL4070LTR插入位点(徐中娟)

MOL4070LTR是一种以莫洛尼小鼠白血病病毒为基础的,且3’LTR区的大部分U3区域被逆转录病毒4070A的LTR序列所取代形成的一种组合型逆转录病毒。它既可以诱导产生高发病率的髓样疾病也可以产生淋巴样肿瘤,且有较广的宿主范围。本研究的目的是通过改进得到的STA-SB-PCR方法摸索并筛选与外源性病毒MOL4070LTR插入后产生白血病相关的基因序列。

目前已经利用外源性病毒MOL4070LTR的序列依据STA-SB-PCR方法的引物设计要求设计了几组相关的扩增引物并选取了几组可能的酶切组合进行实验摸索。经过几次PCR条件的摸索已经基本确定了酶切组合和所需要的扩增引物,图中展示的是分别用正常的FVB系小鼠获得的基因组DNA以及带有这种MOL4070LTR外源性病毒的发病的FVB系小鼠获得的基因组DNA为样本进行STA-SB-PCR操作得到的电泳图。


目前已将这两种PCR产物进行回收、连接、克隆、测序,等待验证是否这些条带相应的序列都为特异性的目的条带,确定其是germline带还是随机插入。下一步计划用相同的条件进行操作看是否可以重复,优化现有的实验条件,筛选外源性病毒MOL4070LTR插入后产生白血病相关的基因序列。

3 多壁纳米碳管对白血病病毒诱导小鼠白血病过程的影响(郑彦文)

研究表明murine leukemia virus (MuLV) 多效逆转录病毒,可以诱导淋巴性(T- and B-cell)和非淋巴性白血病(myeloid, erythroid, megakaryocytic)。近交系C57BL/6等品系小鼠对白血病因子较敏感,可以作为逆转录病毒诱导的白血病模型。也有研究表明碳纳米管具有免疫调节和载体双重性质,激发机体的免疫反应;碳纳米管提升树突细胞对肿瘤抗原的摄取,并增进淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤力。那么,当碳纳米管进入白血病患者体内,是否会与血液细胞相互作用,进而改变恶性肿瘤的进程或状态,有待于深入探索。本实验旨在通过Mol4070LTR病毒感染方法,建立小鼠白血病模型,研究MuLV的致病机制,并初步探索碳纳米管在疾病进程中的影响作用。初步结果如下:

(1)CNT促进了MuLV诱导FVB小鼠发生白血病的进程

本研究选用三个品系C57BL/6,BALB/CJ、FVB小鼠,设置对照组、单纯注射RV组,单纯注射CNT组及RV+CNT组,每组8只小鼠。在出生24 h内,RV组及RV+CNT组小鼠腹腔注射浓缩的Mol4070LTR病毒;然后在Week2,4,6,8,10,12,14,16,CNT组及RV+CNT组皮下注射0.2 mg CNT,并持续观察疾病进程,发病后进行解剖学观察、病理分析及流式检测。结果发现, BALB/CJ及FVB小鼠有明显的发病症状。如小鼠存活曲线图所示(图1):在BALB/CJ小鼠,RV组与RV+CNT组小鼠均在3-4个月之后开始发病,存活率逐渐递减,两组之间无显著差别;CNT组小鼠未见发病。在FVB小鼠,RV+CNT组较RV组小鼠发病迅速,在4个月的时候已经全部死亡,差别显著;CNT组小鼠未发病。


图1 小鼠生存曲线图

另外,小鼠濒死前进行外周血计数显示,RV组与RV+CNT组小鼠外周血白细胞比例明显增高,达到107~108/ml。解剖学观察发现,这两个品系中,RV组与RV+CNT组内部脏器及淋巴结都有不同程度的肿大。如图2所示:


图2:发病小鼠解剖图,箭头所示为肿大部位。

研究的初步结果表明:新生小鼠注射白血病病毒可以诱发小鼠生成白血病,模型建立成功;CNT促进了白血病病毒诱导FVB小鼠白血病的进程。

(2)CNT促进MuLV致FVB小鼠白血病进程具有可重复性

为了进一步验证CNT的这种效应,实验又选取30只FVB小鼠单纯注射RV,30只小鼠注射RV+CNT,结果表明,RV+CNT组小鼠较RV组发病快,见图3生存曲线,表明CNT促进MuLV致FVB小鼠白血病进程具有可重复性。


图3 FVB小鼠生存曲线图

(3)MuLV可诱导FVB小鼠发生髓系/淋系白血病

将FVB对照组(con),RV组及RV+CNT组小鼠骨髓(BM)及淋巴结(LN)中的活细胞,进行淋系marker TCR-β及B220染色,及髓系marker CD11b及Gr-1染色,结果显示,RV及RV+CNT组小鼠或者LN中髓系标志表达增加,或者BM中淋系标志表达增加(图4),表明MuLV可诱导FVB小鼠发生髓系/淋系白血病。


图4 FVB小鼠 BM/LN流式分析

下一步计划:从各个层面对小鼠发病机理进行探索,包括:病理学分析、流式检测、病毒插入位点分析,免疫细胞因子检测,以及使用免疫缺陷Scid小鼠,进行相同的RV及CNT诱导实验,检测免疫反应在该进程中的作用,以深刻揭示RV诱导小鼠白血病的机制,以及CNT促进RV诱导小鼠白血病进程的机制,为临床诊疗提供理论和实验依据。