国家重大科学研究计划项目“生物医学纳米材料对血细胞作用的研究”工作进展与讨论

基于纳米材料的白血病病因和病理学研究

苏州大学 尹斌 教授


我们课题一在过去的4个月里,经过紧张的探索和尝试,取得了一定的进展。现将详细内容汇报如下(2013-9):

1携带APTS-Fe2O3磁性纳米颗粒的SHI-1细胞穿过体外BBB的初步试验(丁莎莎同学-陈子兴教授平台)

主要实验方法:

  1. 以SHI-1为对象,用普鲁士蓝铁染色观察磁性纳米颗粒与SHI-1共培养12h后能否被细胞内吞以及内吞率(约100%)0ug/ml纳米、15ug/ml纳米(1,2)、25ug/ml纳米(1,2),透射电镜观察未做;
  2. 以transwell跨膜实验检测携带磁性纳米颗粒的SHI-1细胞侵袭能力;
  3. 以荧光实时定量PCR检测磁性纳米颗粒对SHI-1细胞CD44、CXCR4、TIMP-1、TIMP-2、MMP-2、MMP-9mRNA表达水平的影响;以未经磁性纳米颗粒处理的SHI-1细胞作为对照组。
  4. Western blot 法检测脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白(ZO-1、Claudin-5、occludin)在SHI-1细胞吞/不吞纳米颗粒后穿膜后的表达情况。

主要实验结果:

(1) SHI细胞吞噬纳米铁的照片


对照:0ug/ml 纳米-吞噬12h后


15ug/ml 纳米-吞噬12h后


25ug/ml 纳米-吞噬12h后

(1) SHI细胞吞噬纳米铁的照片


2多壁纳米碳管对白血病病毒诱导小鼠白血病过程的影响(郑彦文老师-尹斌教授平台)

研究表明murine leukemia virus (MuLV) 多效逆转录病毒,可以诱导淋巴性(T- and B-cell)和非淋巴性白血病(myeloid, erythroid, megakaryocytic)。近交系小鼠对白血病因子较敏感,可以作为逆转录病毒诱导的白血病模型。也有研究表明碳纳米管(CNT)具有免疫调节和载体双重性质,激发机体的免疫反应;碳纳米管提升树突细胞对肿瘤抗原的摄取,并增进淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤力。那么,当碳纳米管进入白血病患者体内,是否会与血液细胞相互作用,进而改变恶性肿瘤的进程或状态,有待于深入探索。本实验旨在通过Mol4070LTR病毒感染方法,建立小鼠白血病模型,研究MuLV的致病机制,并初步探索碳纳米管在疾病进程中的影响作用。初步结果如下:

(1)CNT促进了MuLV诱导小鼠发生白血病的进程

本研究选用某品系小鼠,设置对照组、RV组、CNT组及RV+CNT组,在出生24 h内,RV组及RV+CNT组小鼠腹腔注射浓缩的Mol4070LTR病毒;然后在Week2,4,6,8,10,12,14,16,CNT组及RV+CNT组皮下注射0.2 mg CNT,并持续观察疾病进程。结果发现, 该品系小鼠有明显的发病症状。如小鼠存活曲线图所示(图1):RV+CNT组较RV组小鼠发病迅速,在4个月的时候已经全部死亡,差别显著;CNT组未发病。


图1.小鼠生存曲线图

另外,小鼠濒死前进行外周血计数显示,RV组与RV+CNT组小鼠外周血白细胞比例明显增高,达到107~108/ml。解剖学观察发现, RV组与RV+CNT组内部脏器及淋巴结都有不同程度的肿大。

研究的初步结果表明:新生小鼠注射白血病病毒可以诱发小鼠生成白血病,模型建立成功;CNT促进了白血病病毒诱导小鼠白血病的进程。

(2)CNT促进MuLV致小鼠白血病进程具有可重复性

为了进一步验证CNT的这种效应,实验又选取6只该品系小鼠单纯注射RV,6只小鼠注射RV+CNT,结果表明,RV+CNT组小鼠较RV组发病快,见图2生存曲线,表明CNT促进MuLV致小鼠白血病进程具有可重复性。


图2.小鼠生存曲线图

(3)MuLV可诱导小鼠发生髓系/淋系白血病

将对照组(con),RV组及RV+CNT组小鼠骨髓(BM)及淋巴结(LN)中的活细胞,进行淋系marker TCR-β及B220染色,及髓系marker CD11b及Gr-1染色,结果显示,RV及RV+CNT组小鼠或者LN中髓系标志表达增加,或者BM中淋系标志表达增加(图3),表明MuLV可诱导小鼠发生髓系/淋系白血病。具体的髓系/淋系的比例,尚在统计中。


图3.小鼠 BM/LN流式分析

(4)CNT促进了小鼠血清中免疫因子水平的升高

我们在小鼠发病前及小鼠濒死、解剖时,分别收集各组小鼠外周血清,用ELISA检测血清中炎症因子IL6等的含量水平。已经绘制了部分标准曲线:


图4 mouse IL6的ELISA标准曲线

目前正在检测各组血清样品中各种炎症因子的含量。

(5)CNT促进巨噬细胞分泌炎症因子;CNT诱导的巨噬细胞培养上清能够促进小鼠白血病细胞增殖



图5 CNT诱导的RAW细胞上清促进小鼠白血病细胞增殖

正在进行:从各个层面对小鼠发病机理进行探索,包括:病理学分析、流式检测、病毒插入位点分析,免疫细胞因子检测,以及使用免疫缺陷小鼠,进行相同的RV及CNT诱导实验,检测免疫反应在该进程中的作用,以深刻揭示RV诱导小鼠白血病的机制,以及CNT促进RV诱导小鼠白血病进程的机制,为临床诊疗提供理论和实验依据。

3 原位移植急性髓系白血病浸润模型的建立(陶惠泉博士-尹斌教授平台)

实验目的:以9种白血病细胞(B113,114, 117, 139, 140, 186, 162,151等)尝试建立B6C3H(F1)小鼠原位移植白血病模型和白血病浸润模型。

实验步骤:

  1. 繁殖B6C3H(F1)小鼠;
  2. 尾静脉注射细胞;
  3. 血细胞检测;
  4. 处死,解剖,观察;

实验结果:至少有一种细胞可以在导致小鼠患上白血病的同时发生浸润。


图1:发病小鼠血涂片


图2:在小鼠肠道出现的浸润瘤


图3:发病小鼠的脾脏与肝脏切片

已发表/接受发表(标注本课题资助基金号)论文 截止到2013-8

2013年

  1. A BCR-JAK2 fusion gene from ins(22;9)(q11;p13p24) in a patient with atypical chronic myeloid Leukemia. Leuk Lymphoma. 2013 Feb 25. [Chen SN, et al.]
  2. Somatic mutations of PHF6 in patients with chronic myeloid leukemia in blast crisis. Leuk Lymphoma. 2013 Mar;54(3):671-2. [Chen SN, et al.]
  3. Rare occurrence of the JAK1 mutation in APL patients. Acta Haematol. (accepted)[Chen SN, et al.]
  4. EZH2 mutations are related to low blast percentage in bone marrow and -7/del(7q) in de novo acute myeloid leukemia. Plos One(in press)[Chen SN, et al.]
  5. The cellular evolutionary entity, epigenetic alterations and microenvironment of myelodysplastic syndromes- a working hypothesis of MDS pathogenesis. Myelodysplastic Syndromes. 2013. Chapter IX. [Chen ZX, et al.]
  6. IK6 isoform with associated cytogenetic and molecular abnormalities in Chinese patients with Philadelphia chromosome-positive adult acute lymphoblastic leukemia. Leuk Lymphoma.(accepted)[Chen ZX, et al.]
  7. Epigenetic silencing of Bcl-2, CEBPA and p14ARF by the AML1-ETO oncoprotein contributing to growth arrest and differentiation block in U937 cell line. Oncology Report. 2013;30:185-192. [Chen ZX, et al.]
  8. A promising combo gene delivery system developed from (3-aminopropyl) triethoxysilane-modified iron oxide nanoparticles and cationic polymers. Nanoparticle Research. (accepted)[Mao XL, et al.]
  9. A Non-Genetic Approach to Labelling Acute Myeloid Leukemia and Bone Marrow Cells with Quantum Dots. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. (accepted). [Yin B, et al.]
  10. The development of APE-PCR for the cloning of genomic insertion sites of DNA elements. Biologia. (accepted). [Yin B, et al.]
  11. PML-RARα cooperates with SOX4 in acute myeloid leukemia. Haematologica. 2013, Mar;98(3):424-7. [Yin B, et al.]

2012年

  1. Rap1GAP alters leukemia cell differentiation, apoptosis and invasion in vivo. Oncology Report. [Chen ZX, et al.]
  2. Absence of BRAFV600E mutation in hematologic malignancies excluding hairy-cell leukemia. Leuk Lymphoma. [Chen SN, et al.]
  3. Clinical, immunophenotypic, cytogenetic, and molecular genetic features in 117 adult patients with mixed-phenotype acute leukemia defined by WHO-2008 classification. Haematologica. [Chen SN, et al.]
  4. Absence of DNMT3A gene mutation in chronic myeloid leukemia patients in blast crisis. Eur J Haematol. [Chen ZX, Chen SN, et al.]
  5. The utility of fluorescence in situ hybridization analysis in diagnosing myelodysplastic syndromes is limited to cases with karyotype failure. Leuk Res. [Chen SN, et al.]
  6. Acute promyelocytic leukemia with a STAT5b-RARα fusion transcript defined by array-CGH, FISH, and RT-PCR. Cancer Genet [Chen SN, et al.]

2011年

  1. A small-molecule inhibitor of D-cyclin transactivation displays preclinical efficacy in myeloma and leukemia via phosphoinositide 3-kinase pathway. Blood. [Mao XL, et al.]
  2. Exploring the old drugs for the therapeutics of hematological malignancies. Current Medicinal Chemistry. [Mao XL, et al.]
  3. Matrix metalloproteinase-2 and -9 secreted by leukemic cells increase the permeability of blood-brain barrier by disrupting tight junction proteins. Plos One. [Chen ZX, et al.]
  4. Mutations of PHF6 are associated with mutations of NOTCH1, JAK1 and rearrangement of SET-NUP214 in T-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. [Chen SN, et al.]
  5. Establishment and characterization of a novel acute myeloid leukemia cell line, JIH-4, carrying a t(16;21)(p11.2;q22) and expressing the FUS-ERG fusion. Cancer Genetics. [Chen SN, et al.]
  6. Isolation of Genomic Insertion Sites of DNA element using Splinkerette-PCR based Procedures. Methods Mol Biol. [Yin B, et al.]
  7. Functional genetic variations of cyclooxygenase-2 and susceptibility to acute myeloid leukemia in a Chinese population. Eur J Haematol [Chen SN, et al.]