国家重大科学研究计划项目“生物医学纳米材料对血细胞作用的研究”工作进展与讨论

纳米材料对血液免疫功能细胞的作用及其在白血病免疫治疗中的新方法研究

中国医学科学院基础医学研究所 许海燕 教授
(本期内容由曹济民课题组提供)


1. 多壁碳纳米管(MWCNT)对心肌细胞Kv4.2/4.3钾通道动力学、表达、转运的影响,以及MWCNT诱发房室传导阻滞的研究

目的:关于多壁碳纳米管(MWCNT)对心脏电生理潜在的危害性几乎还未报道,我们早期研究发现多壁碳纳米管抑制PC12细胞中多种钾离子通道,包括Ito通道。本课题旨在研究多壁碳纳米管对心肌细胞Ito通道的抑制作用,并利用工具细胞HEK293分析器可能机制;进一步研究MWCNT对心肌细胞动作电位和心律的影响。

方法:构建了异源表达Kv4.2和Kv4.3通道α亚单位或共表达KChIP2辅助亚单位的HEK293细胞系,采用一系列方法,包括膜片钳技术、流式细胞术、细胞免疫荧光、生物素化法提膜蛋白、免疫共沉淀和Western blotting等,来研究MWCNT对通道动力学、表达及转运的影响。采用电流钳模式记录急性酶分离的大鼠心肌细胞动作电位。在开胸手术下记录MWCNT对大鼠体表心电图和单向动作电位的影响。

结果:MWCNT短时间(约20 min内)孵育细胞并没有影响表达在HEK293细胞中的Kv4.2通道电流。然而将MWCNT加入电极液中很快加快了共表达KChIP2辅助亚单位的HEK293细胞IKv4.2的衰减,促进了单独表达Kv4.2通道的HEK293细胞中IKv4.2的失活后恢复。但是MWCNT没有影响两种细胞系中Kv4.2通道激活和失活的电压依赖性。长时间(6 h)孵育HEK293细胞获得了与电极液中MWCNT一致的效果,即加快了Kv4.2+KChIP2组细胞IKv4.2电流的衰减,促进单独表达Kv4.2通道的电流的失活后恢复,不影响通道激活与失活的电压依赖性。此外,多壁碳纳米管6 h孵育降低了IKv4.2的电流密度,下调了Kv4.2通道蛋白的表达,对KChIP2辅助亚单位的表达无明显影响,抑制了Kv4.2蛋白向质膜的转运。MWCNT对Kv4.3通道的作用与Kv4.2通道非常相似。在急性酶分离的大鼠心肌细胞中,电极液中的MWCNT同样很快加速了IKv4.2的衰减,延长了动作电位时程,但是没有影响通道激活与失活的电压依赖性和Ito通道的恢复。大鼠静脉给予MWCNT(每只鼠2 mg)诱发了心动过缓、房室传导阻滞、室内传导阻滞甚至心博停止骤停,未发现MWCNT诱发快速型心律失常。

结论:MWCNT影响了Kv4.2/Kv4.3通道的活动,包括电流密度、通道动力学、表达以及转运等,KChIP2可能参与了部分作用。这些对钾通道的抑制作用可能是导致动作电位延长和缓慢型心律失常的发生。联系到MWCNT在毒性分级上属于“有毒”(toxic),其对心脏电生理学的毒性作用在纳米医学实践中应该予以重视。

2. 多壁碳纳米管(MWCNT)抑制RAW264.7巨噬细胞的吞噬功能

目的:观察多壁碳纳米管(MWCNT)对巨噬细胞吞噬功能的影响。

方法:采用常规细胞培养技术培养RAW264.7巨噬细胞;用流式细胞术定量检测RAW264.7巨噬细胞吞噬异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌(FITC-tagged E.coli k-12)的情况。

结果:MWCNT剂量依赖性地抑制RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌:随着MWCNT浓度的增加,RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌的量(用平均荧光强度表示)降低。此外,MWCNT抑制RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌亦呈现时间依赖性:用MWCNT (75 μg/ml) 孵育RAW264.7细胞12 h后,RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌的量与对照组相比降低了约70.4%(P<0.01),同时参与吞噬活动的RAW264.7细胞的百分比也从对照组的98.6%降低到了92.4%(P<0.05)。即使用低剂量的MWCNT(25 μg/ml)孵育RAW264.7细胞较长时间(24 h)后,RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌的量与对照组相比仍降低了约77.1%(P<0.01),同时参与吞噬活动的RAW264.7细胞的百分比也从71.2%降低到了43.4%(P<0.01)。用脂多糖(LPS,10 μg/ml)激活RAW264.7细胞后,其吞噬能力明显增强,而MWCNT仍可剂量依赖性地抑制LPS激活的RAW264.7细胞的吞噬能力,与LPS组相比,MWCNT (75 μg/ml)和 LPS共孵育组吞噬大肠杆菌的量降低了70.9%(P<0.01)。用工具药干涉Kv1.3通道可在一定程度上影响MWCNT的上述抑制吞噬的作用。

结论:MWCNT可明显抑制RAW264.7巨噬细胞的吞噬功能,这一效应可能与MWCNT影响Kv1.3通道的功能有关。

3. 超顺磁性氧化铁纳米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPION)抑制Jurkat 细胞Kv1.3通道

Jurkat 细胞是T淋巴细胞性白血病细胞系的一种,是研究白血病的常用工具细胞。已知Kv1.3 通道与T细胞的增殖、分化、激活和免疫突触的形成等多种免疫活动有关,但Jurkat 细胞Kv1.3 通道的功能,以及铁纳米材料对Jurkat 细胞Kv1.3 通道的影响,目前并不十分清楚。SPION是一种很有前途的核磁共振造影剂,在投入临床应用之前,有必要就其对免疫细胞及白血病细胞的影响做一评估。本课题主要研究SPION对Jurkat E6-1细胞Kv1.3 通道电流以及通道动力学特征的影响进行了初步观察。膜片钳实验结果显示,SPION可减小Kv1.3 通道电流密度,抑制通道失活,但对该通道的恢复动力学无明显影响。这些初步结果提示,SPION可能通过影响Jurkat 细胞的Kv1.3 通道的活动,进而可能对Jurkat 细胞的增殖、分化和侵袭等活动产生某种干扰。