国家重大科学研究计划项目“生物医学纳米材料对血细胞作用的研究”工作进展与讨论

生物纳米探针对血液恶性肿瘤细胞的体外作用与检测研究

南京大学 朱俊杰 教授


1. 双金属钯/铂/石墨烯复合金电极促进的氧化还原循环反应用于细胞裂解液内microRNA的电化学检测

MicroRNAs (miRNAs),约22个核苷酸大小的内源性非编码RNAs,其表达水平与人类重大疾病如癌症等密切相关,因而miRNA 可以作为新的生物标志物用于癌症等重大疾病的早期诊断。由于miRNA 序列短、在细胞内的表达水平比较低,而且许多同源miRNA序列相似度高,使miRNA检测困难。传统miRNAs检测方法包括实时反转录聚合酶链式反应,Northern 印迹技术和微阵列芯片。但是这些方法都存在灵敏度低、费时和需要大量RNA样品等缺点。电化学技术具有灵敏度高,简单易操作和成本低等优点,并已被广泛用于生物测定。本文结合氧化还原循环反应、碱性磷酸脂酶以及石墨烯/钯/铂修饰丝网印刷金电极的催化性能,利用两个loop结构DNA作为捕获探针发展了一种三重信号放大检测细胞裂解液中miRNA的电化学方法。利用Michael加成反应将捕获探针DNA1修饰到多巴胺包裹的Fe3O4纳米球表面,通过类似夹心法捕获miRNA和DNA2。利用生物素修饰DNA2与 SA-ALP结合,ALP催化底物p-NPP生成电化学活性的p-NP,再利用石墨烯/钯/铂修饰丝网印刷金电极进行检测,同时利用TCEP的氧化还原实现三步放大。该传感器的线性检测范围为10 fM~0.1nM,检测限为3.55 fM,并且可以很好区分目标miRNA和家族其他碱基序列相近的miRNA。表明该传感器具有高灵敏度,高选择性以及高准确性,可以作为一种新颖的miRNA检测方法。


图1. 三重信号放大检测细胞裂解液中miRNA的电化学方法

2. 慢性髓性白血病细胞的药物评估体系 : 活性caspase-3的电化学检测平台

近年来,慢性髓性白血病(CML)的发病率呈现逐年上升的趋势,这对相应的诊疗手段造成了严峻的考验。目前慢性髓性白血病最有效的治疗手段是骨髓移植,但是骨髓配型的成功率低下,极大限制了该项技术的应用,因此发展一种行之有效的药物体系控制疾病的发展甚至治疗疾病势在必行。达沙替尼是一种多重激酶抑制剂,可以有效靶向慢性髓性白血病的原癌基因BCR/ABL,抑制基因的活性,促进癌细胞凋亡,从而达到治疗疾病的目的。但是过多的使用该药物容易引发肺动脉高压,同时增加疾病的耐药性,使药效减弱。TRAIL蛋白可以有效结合肿瘤细胞表面过表达的死亡受体DR4和DR5,从而有效进入细胞内部,促进肿瘤细胞的凋亡。因此,将达沙替尼和TRAIL蛋白结合,用于慢性髓性白血病的治疗,将具有一定的前景,为此,我们设计了一种新颖的电化学传感平台用于检测细胞凋亡产生caspase-3并对药物的疗效进行评价。该传感器以修饰有AuNPs/PDDA/CNTs纳米复合材料的玻碳电极为基底,通过金硫键固定末端含有半胱氨酸残基的多肽,多肽可以有效被细胞凋亡生成的caspase-3剪切,剩余的多肽则可以有效结合碱性磷酸酯酶(ALP)。ALP酶水解底物2-磷酸-1-抗坏血酸(AAP)生成抗坏血酸(AA),通过检测抗坏血酸电化学信号,可以间接有效的测定caspase-3的活性,并进一步了解药物作用肿瘤细胞并促使细胞凋亡的情况,达到药物疗效评估的目的。实验表明,针对CML系K562细胞,达沙替尼和TRAIL联合疗法比单独使用两种药物具有更加显著的疗效,这对慢性髓性白血病的治疗具有潜在的应用价值。相比其他传感器,该传感平台利用了酶催化反应的高效环保,检测过程不会破坏传感器结构,因此可以重复检测。同时,该传感平台还可以用于其他疾病细胞凋亡的检测以及其它药物疗效的评估,具有广阔的潜在应用前景。


图2. 传感平台的构建及检测原理图