2017年11月- 间充质和神经干细胞的体内动态示踪技术与临床转化研究

干细胞体内示踪的生物机制

发布时间:2020-05-06发件人:消息来源:江苏省生物材料与器件重点实验室

国家重点研发计划项目“间充质和神经干细胞的体内动态示踪技术与临床转化研究”工作进展

东南大学;南京大学  唐明亮研究员;姚红红教授;巢杰教授;王婷婷教授


SPIO入胞机制及分布初探

东南大学 唐明亮 研究员

本年度在以下几个方面开展了与课题相关的工作:1)初步研究了超顺磁性氧化铁(SPIO)对神经干细胞摄入、迁移等行为的影响。实验提取了胎鼠海马部位的神经干细胞,并将其纯化作为实验细胞。实验中采用的SPIO分为多聚赖氨酸(PLL)包被和不包被的两种形式,未经PLL包被的SPIO进入神经干细胞含量较少,经过PLL包被的SPIO(PLL—SPIO)进入神经干细胞的含量较多。这两种形式的材料可能会对干细胞的行为产生不同影响。首先前期为了促进干细胞内吞材料的量,选择了聚赖氨酸包被的材料处理干细胞,通过普鲁士蓝染色确定材料顺利被干细胞吞入,并且随着材料浓度的增加吞载量增加,同时通过ICP-MS定量分析不同时间处理细胞吞载材料量,发现结果与普鲁士蓝定性实验趋势一致。通过cck-8,EDU,western blot等实验确定包被材料对干细胞增殖的影响。从前期结果看,包被材料短时间(24小时)内对干细胞增殖无影响,长时间对干细胞增殖有抑制作用。为了确定包被材料对干细胞分化的影响,选择材料处理细胞不同时间进行免疫荧光染色,通过染神经元及胶质细胞特异性抗体确定材料对干细胞定向分化的影响。同时,在外加磁场的条件下研究干细胞吞入材料后对外加的响应情况。具体通过观察外加磁场条件下,标记材料的干细胞的迁移方向、速度等与未标记材料的区别。由于前期的研究结果显示在包被材料可能会对干细胞增殖分化等行为产生消极影响,故目前本课题开始尝试直接将不经任何包被的材料与细胞共孵育,观察其对干细胞增殖、分化、迁移等行为的影响。目前的结果观察到材料有可能对细胞的增殖起到积极作用,还需要进一步验证这个结果。2)初步以原代培养的细胞为研究对象,研究了SPIO进入螺旋神经元的情况,发现SPIO也能内吞进入螺旋神经元,并且含量随着孵育浓度提高而增加,同时发现孵育时间越长其含量也越高。进一步的研究发现,SPIO在500μg/ml的浓度下对螺旋神经元的活性没有影响,对螺旋神经元发育的影响还在进行中。


SPIO标记骨髓间充质干细胞的脑内迁移情况研究

非编码RNA对于骨髓间充质干细胞增殖分化等能力的作用

东南大学 姚红红 教授


初步研究SPIO标记的骨髓间充质干细胞在小鼠脑中迁移情况。实验通过脑微注射方法向小鼠海马区域注射标记骨髓间充质干细胞,观察3天、7天、14天骨髓间充质干细胞在脑区中迁移情况,结果表明,在3天、7天、14天均检测到骨髓间充质干细胞迁移情况,通过普鲁士蓝和荧光共染色实验证明,确实为材料标记的骨髓间充质干细胞发生定向迁移。通过骨髓间充质干细胞、GFP、NeuN染色实验表明,骨髓间充质干细胞、GFP、NeuN存在共染情况。

初步研究非编码RNA对于骨髓间充质干细胞增殖分化等能力的影响。通过筛选确定circHECTD1并对细胞进行转染,CCK8实验结果表明circHECTD1显著上调骨髓间充质干细胞的增殖能力,SPIO标记后,虽然细胞增殖能力有所下降,但是仍然显著高于对照细胞。该circHECTD1对于骨髓间充质干细胞的分化能力的影响尚在进行之中。

本年度在杂志Stem CellsInternational发表综述1篇,题为PotentialTherapeutic Mechanisms and Tracking of Transplanted Stem Cells: Implicationsfor Stroke Treatment。改文章摘要如下:Stem cell therapy is apromising potential therapeutic strategy to treat cerebral ischemia inpreclinical and clinical trials. Currently proposed treatments for strokeemploying stem cells include the replacement of lost neurons and integrationinto the existing host circuitry, the release of growth factors to support andpromote endogenous repair processes, and the secretion of extracellularvesicles containing proteins, noncoding RNA, or DNA to regulate gene expressionin recipient cells and achieve immunomodulation. Progress has been made toelucidate the precise mechanisms underlying stem cell therapy and the homing,migration, distribution, and differentiation of transplanted stem cells in vivousing various imaging modalities. Noninvasive and safe tracer agents with highsensitivity and image resolution must be combined with long-term monitoringusing imaging technology to determine the optimal therapy for stroke in termsof administration route, dosage, and timing. This review discusses potentialtherapeutic mechanisms of stem cell transplantation for the treatment of strokeand the limitations of current therapies. Methods to label transplanted cellsand existing imaging systems for stem cell labeling and in vivo tracking willalso be discussed.


示踪剂标记的干细胞治疗SiO2诱导肺纤维化的机制研究

circHECTD1/HECTD1在SiO2诱导的炎症和纤维化中的作用机制研究

东南大学 巢杰 教授


构建SiO2的体外和体内刺激模型,针对SiO2导致的炎症和纤维化,初步寻找干细胞对肺泡巨噬细胞和肺内皮细胞的治疗靶标,经高通量筛选和分子生物学等手段,初步确认非编码RNA中环状RNA-circHECTD1在矽肺炎症中的作用。

矽肺(Silicosis)是由于吸入大量游离的二氧化硅(SiO2)所引起的肺纤维化疾病,主要表现为SiO2诱导的炎症反应和后继的肺纤维化。目前,矽肺的发病机制尚无定论,缺乏有效的诊疗措施,主要以预防为主。环状RNA(circular RNAs,circRNAs)是一种新型的非编码RNA,广泛的参与了疾病进程,但在矽肺发生发展中的作用机制仍不清楚。本课题旨在探讨circHECTD1在SiO2诱导的炎症反应和后继的肺纤维化中的作用机制,以期为矽肺的诊断和治疗提供新的靶点和思路。

方法如下:1)为观察矽肺中circRNAs的表达分布,建立矽肺动物和细胞模型。a)高通量芯片测序技术检测circRNAs在小鼠肺组织中的差异表达;b)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测小鼠肺泡巨噬细胞/RAW 264.7和小鼠上皮细胞(MLE12)中circHECTD1的表达;c)原位杂交实验观察circHECTD1在RAW 264.7和MLE12中的表达和分布。2)circHECTD1/HECTD1在SiO2诱导巨噬细胞活化中的作用机制。a)慢病毒调控RAW 264.7中circHECTD1的表达;b)蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)、MTT和3D迁移模型分别检测circHECTD1对RAW 264.7极性改变、细胞活力和迁移能力的影响;c)WB、qRT-PCR结合细胞免疫荧光检测RAW 264.7中HECTD1的表达;d)CRISPR/Cas9技术调控RAW 264.7中HECTD1的表达;e)WB检测HECTD1/ZC3H12A对RAW 264.7极性改变的影响;f)Co-IP实验检测HECTD1与MCP-1诱导蛋白(MCPIP1/ZC3H12A)之间的相互作用;g)RIP实验检测circHECTD1与ZC3H12A之间的相互作用;h)细胞划痕实验观察巨噬细胞条件培养基对成纤维细胞迁移的影响。

结果发现:1)高通量芯片测序发现小鼠矽肺模型肺组织中有120个circRNAs差异表达,其中73个上调,47个下调;circHECTD1在小鼠肺泡巨噬细胞和RAW 264.7中表达均降低,但在MLE12中表达升高;circHECTD1在RAW 264.7和MLE12中主要在细胞质中表达。2)SiO2诱导RAW 264.7中circHECTD1降低的同时,增高HECTD1的表达;circHECTD1/HECTD1/ZC3H12A介导的泛素化参与了SiO2诱导RAW 264.7活化的调节;circHECTD1/HECTD1通路参与了巨噬细胞活化引起的成纤维细胞迁移;矽肺病人肺泡巨噬细胞中的HECTD1呈高表达。本研究揭示了circHECTD1/HECTD1在SiO2诱导的巨噬细胞活化中的重要作用,为矽肺的临床诊疗提供了新的策略。


本部分研究结果已发表在Theranostics.2018; 8:575-592.



肝脏损伤动物模型的探索

南京大学 侯亚义 王婷婷 教授


本年度完成了对肝脏损伤动物模型的探索,共建立了脓毒症诱导的肝损伤模型和慢性肝损伤导致的肝衰竭两种动物模型。后续将在活体状态下实时匹配示踪剂和经典荧光标记干细胞的动态分布,评价示踪剂标记的干细胞实现体内示踪的可靠性,为示踪剂标记干细胞体内治疗的可视化提供实验证据。