2018年5月- 间充质和神经干细胞的体内动态示踪技术与临床转化研究

干细胞纳米示踪剂的研制

发布时间:2020-05-07发件人:消息来源:江苏省生物材料与器件重点实验室

国家重点研发计划项目“间充质和神经干细胞的体内动态示踪技术与临床转化研究”工作进展

东南大学,中科院苏州纳米所,南京大学  孙剑飞,张智军,邓宗武,索广力,华子春


一、中低频可调脉冲磁场的研制及调控磁性纳米颗粒标记间充质干细胞

东南大学 孙剑飞教授


1、中低频可调脉冲磁场的研发

细胞可以被看作电阻与电容组合而成的电学模型。当磁场频率越高时,产生的感应电场频率越高,此时可以近似将电容看作短路,此时脉冲磁场对细胞的生物效应必然与低频磁场对细胞的生物效应不同。通过调研发现目前市面上的生物实验用脉冲磁场发生器都存在着一些局限性,例如不能够进行多参数的调节,一般只能调节一到两个参数,且一般频率都较低(100Hz以下)等。为此,我们针对在生物实验中需要用到的磁场强度、频率、磁场分布、占空比等特点,设计研发了一台可用于细胞实验的磁场频率、磁场强度、占空比等多参数可调的中低频脉冲磁场发生器。

综合各种不同种类脉冲磁场发生器的拓扑原理,结合单通道脉冲磁场发生器的优点与生物实验的实际需求,提出了一种新颖的脉冲磁场发生器拓扑结构——脉冲参数可控型多通道磁场发生器,拓扑原理如图1所示,其中,图1(a)为利用PLECS软件模拟的脉冲磁场电路图,图1(b)为模拟得到的线圈中电流波形图。

(a)基本电路原理                           (b)线圈电流波形

1. 多参数可调脉冲磁场发生器原理及线圈电流波形。


多参数可调的脉冲磁场发生器的线圈由一个独立的通道进行控制,采用IGBT做充、放电开关,通过控制IGBT的导通和关断时间可以对每个通道刺激线圈内脉冲电流的参数(频率、占空比)进行调节,通过连接不同电感的负载线圈控制脉冲磁场的场强大小,大大提高了系统工作的灵活性。

多参数可控型脉冲磁场发生器是由几个部分组合而成的,主要包括主电路、控制电路和刺激线圈组成。其中主电路包括直流电源、储能电容及可控型功率开关等。整个系统的整体结构框图如图2(a)所示,脉冲磁场仪器电路搭建示意图如图2(b)所示。

(a)整体结构框图      (b)脉冲磁场搭建示意图

2. 系统整体框图及仪器搭建示意图


通过对充电开关进行控制,使高压直流电源经过充电回路向高压储能电容充电。充电结束时,储能电容两端的电压高低,直接决定了刺激线圈流过电流的大小和产生磁场的强度。当储能电容被充满电时,断开充电开关,控制放电开关导通,电容通过放电回路向刺激线圈放电,在线圈内产生瞬时的强电流脉冲。当设定时间到达时,断开放电开关,线圈内的电流通过续流回路续流并渐小为零。同时,刺激线圈内脉冲电流的频率可以通过充、放电开关的导通时间进行调节。


2、脉冲磁场对SD大鼠脂肪间充质干细胞活力及数量的影响检测

通过CCK-8试剂盒检测脉冲磁场刺激不同时间后SD大鼠脂肪间充质干细胞的活性。从图3可以看出,与对照组相比,接受脉冲磁场刺激的细胞活性都在90%以上,活力较高,并且不同脉冲磁场刺激时间对细胞的活力影响差别不大。结果表明,本实验所用的脉冲磁场对细胞活性无明显影响。Fe2O3磁性纳米颗粒与脉冲磁场共同刺激的SD大鼠脂肪间充质干细胞活性都在90%以上,活力较高,并且Fe2O3磁性纳米颗粒与脉冲磁场共同刺激的时间对细胞的活力影响差别不大。结果表明,本实验所用的Fe2O3磁性纳米颗粒与脉冲磁场共同作用对细胞活性无明显影响。从图4中可以看出Fe2O3磁性纳米颗粒与脉冲磁场共同作用对SD大鼠脂肪间充质细胞或人脐带间充质干细胞的数量均无明显影响。

3.  SD-ADSCs细胞活力表征:a,脉冲磁场作用后SD-ADSCs活力;b,脉冲磁场与Fe2O3共同作用后SD-ADSCs活力



4. 间充质干细胞数量表征: a,脉冲磁场与Fe2O3共同间隔作用后SD-ADSCs数量;b,脉冲磁场与Fe2O3共同连续作用后SD-ADSCs数量; c,脉冲磁场与Fe2O3共同间隔作用后MSCs数量;d,脉冲磁场与Fe2O3共同连续作用后MSCs数量


3、ICP-OES定量检测细胞内铁含量

通过ICP-OES定量检测了间充质干细胞在不同强度、不同频率的脉冲磁场调控下标记Fe2O3磁性纳米颗粒后的细胞内铁含量情况,不同细胞状态、不同孵育时间、颗粒加入的先后顺序对Fe2O3磁性纳米颗粒标记间充质干细胞的影响。


3.1不同强度脉冲磁场刺激后SD-ADSCs内铁含量

通过ICP-OES定量检测了SD大鼠脂肪间充质干细胞在不同强度脉冲磁场调控下标记Fe2O3磁性纳米颗粒后细胞内铁含量情况。由图5可以看出,当施加了脉冲磁场之后,细胞标记磁性纳米颗粒的量呈现减少趋势,不同强度的脉冲磁场对Fe2O3磁性纳米颗粒标记SD大鼠脂肪间充质干细胞的影响不同。因此综合上述数据,对不同强度的脉冲磁场刺激后Fe2O3磁性纳米颗粒标记SD大鼠脂肪间充质干细胞占对照组的百分比进行了统计,如图6所示。随着磁场强度的加大,脉冲磁场的作用效果越来越明显,Fe2O3磁性纳米颗粒标记SD大鼠脂肪间充质干细胞的量随着脉冲磁场强度的增大而减少。在脉冲磁场强度为3.5mT时,Fe2O3磁性纳米颗粒标记SD大鼠脂肪间充质干细胞的量仅为对照组的55%左右。

图5. SD-ADSC在不同强度脉冲磁场调控后细胞内铁含量表征:a,脉冲磁场强度为3.5mT,间隔刺激;b,脉冲磁场强度为3.5mT,连续刺激; c,脉冲磁场强度为2.6mT,间隔刺激;d,脉冲磁场强度为2.6mT,连续刺激;e,脉冲磁场强度为1.9mT,间隔刺激;f,脉冲磁场强度为1.9mT,连续刺激


6. SD-ADSC在不同强度脉冲磁场调控后细胞内Fe2O3磁性纳米颗粒占对照组的百分比。


3.2不同频率脉冲磁场刺激后SD-ADSCs内铁含量

通过ICP-OES定量检测了SD大鼠脂肪间充质干细胞在不同频率脉冲磁场调控下标记Fe2O3磁性纳米颗粒后细胞内铁含量情况。由图7可以看出,当施加了脉冲磁场之后,细胞标记磁性纳米颗粒的量呈现减少趋势。不同频率的脉冲磁场对Fe2O3磁性纳米颗粒标记SD大鼠脂肪间充质干细胞的影响不同,随着磁场频率的减小,脉冲磁场的抑制效果越来越明显。在脉冲磁场强度为5kHz时,Fe2O3磁性纳米颗粒标记间充质干细胞的量为对照组的55%左右,而在脉冲磁场强度为3kHz时,Fe2O3磁性纳米颗粒标记间充质干细胞的量为对照组的45%左右。有趣的是,当脉冲磁场频率降到10Hz时,低频脉冲磁场却能够促进磁性纳米颗粒标记间充质干细胞,这是与文献上的结果相一致的。


7. SD-ADSC在不同频率脉冲磁场调控后细胞内铁含量表征:a,脉冲磁场频率为5kHz,间隔刺激;b,脉冲磁场频率为5kHz,连续刺激;c,脉冲磁场频率为3kHz,间隔刺激;d,脉冲磁场频率为3kHz,连续刺激。


4、透射电子显微镜检测Fe2O3磁性纳米颗粒的细胞内吞

通过透射电子显微镜定性检测了脉冲磁场调控Fe2O3磁性纳米颗粒标记SD大鼠脂肪间充质干细胞的情况。由图8可以看出,当SD大鼠脂肪间充质干细胞培养于细胞培养基中时,细胞内没有发现Fe2O3磁性纳米颗粒标记;当SD大鼠脂肪间充质干细胞培养于完全培养基与Fe2O3磁性纳米颗粒的混合物中时,细胞内的Fe2O3磁性纳米颗粒主要存在于囊泡中,如图8(b)所示;当SD大鼠脂肪间充质干细胞培养于完全培养基与Fe2O3磁性纳米颗粒的混合物中,并加入脉冲磁场刺激后,细胞内的Fe2O3磁性纳米颗粒主要存在于细胞质中,如图8(c)、(d)所示。


图8. 透射电子显微镜检测Fe2O3磁性纳米颗粒的细胞内化 a:无Fe2O3磁性纳米颗粒,无脉冲磁场;b:加入Fe2O3磁性纳米颗粒,无脉冲磁场;c:加入Fe2O3磁性纳米颗粒,脉冲磁场刺激三次,每次1min;d:加入Fe2O3磁性纳米颗粒,脉冲磁场连续刺激5min。


为了探究脉冲磁场影响Fe2O3磁性纳米颗粒标记间充质干细胞是磁的作用还是感应产生的电场的作用,通过ICP-OES定量检测了SD大鼠脂肪间充质干细胞在不同频率脉冲磁场调控下标记金纳米颗粒后细胞内金含量情况。发现中频和低频脉冲磁场对金纳米颗粒标记SD大鼠脂肪间充质干细胞无明显影响。综合上述数据,对比不同频率的脉冲磁场刺激后Fe2O3磁性纳米颗粒标记SD大鼠脂肪间充质干细胞的情况可以发现,脉冲磁场并不能够影响金纳米颗粒标记干细胞,脉冲磁场只能够调控Fe2O3磁性纳米颗粒标记干细胞。由此判断,脉冲磁场的主要作用是空间中的磁场,而不是感应产生的电场。


二、新型干细胞CT示踪剂的研制

中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所张智军研究员


以牛血清白蛋白为模板制备金纳米粒子(Au@BSA),其具有较好的生物相容性,以及易于大量制备、易于冻干储存的优点;在其表面负载ICG染料,获得可用于活体近红外-CT多模态成像的干细胞纳米示踪剂(Au@BSA-ICG)。制得的金纳米粒子平均粒径为11nm(图9a),Zeta电势为+19.6mV,携带正电荷便于细胞摄取。在负载ICG后,染料的紫外可见吸收峰发生红移,证明ICG已成功负载在Au@BSA表面(图9b)。通过CT检测初步验证Au@BSA-ICG具有优于商用碘基造影剂——碘佛醇4.4倍的X射线衰减能力(图9c):

图9. Au@BSA-ICG表征

a.TEM表明纳米粒子粒径分布均匀;b.紫外可见吸收光谱表征;c.CT造影效果


通过将Au@BSA-ICG添加到人脐带间充质干细胞的培养液中,使细胞通过胞吞的途径摄取示踪剂。当Au质量浓度达300ug/ml时,细胞仍然保持很好的活力(图10a);同时相比于对照组,孵育浓度为300ug(Au)/ml时细胞已有显著CT信号(图10b):



图10. 间充质干细胞摄取Au@BSA-ICG示踪剂

a.细胞毒性;b.CT造影效果



三、小分子Gd示踪剂的研制

中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所邓宗武研究员

设计并合成了可体外化学自组装的小分子Gd基示踪剂Gd-CBT(图11),用于体外缩合条件摸索。目前可控制在水溶液中缩合自组装的Gd-NP的尺寸主要分布在600 nm左右(图12),电转标记人源间充质干细胞(hMSCs)于11.7T MRI呈明显T2加权暗信号(图13)。



图11. Gd-CBT结构式


图12. Gd-NP的TEM


图13. Gd-CBT与Gd-DNP标记hMSCs的T1加权像和T2加权像@11.7T MRT




四、用于示踪的纳米材料毒理研究。

中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所索广力研究员

合成携带不同数量电荷的碳纳米量子点,用于标记脐带间充质干细胞,检测不同电荷的碳纳米量子点对干细胞的存活、增殖、毒性、干性、摄取能力、排除能力和稳定性等方面的影响,研究碳纳米量子用于干细胞标记示踪的可行性。相关研究结果近期发表在国际刊物Colloids SurfB Biointerfaces。


五、表达、纯化凋亡检测探针。

南京大学 华子春教授

表达、纯化了18种不同颜色的Anx V-FPs凋亡检测探针,研究了18种不同颜色的Anx V-FPs凋亡检测探针的聚集状态、荧光光谱等基本特性,在细胞水平上检测了融合蛋白与PS结合能力,初步筛选出适用于小动物成像的荧光蛋白标记的Anx V融合蛋白。