2018年3月- 间充质和神经干细胞的体内动态示踪技术与临床转化研究

干细胞体内示踪的生物机制

发布时间:2020-05-07发件人:消息来源:江苏省生物材料与器件重点实验室

国家重点研发计划项目“间充质和神经干细胞的体内动态示踪技术与临床转化研究”工作进展

东南大学;南京大学  唐明亮研究员;姚红红教授;巢杰教授;王婷婷教授

于纳米材料标记的神经干细胞的体内示踪

东南大学 唐明亮 研究员

铱纳米微球用于神经干细胞标记并进行活体示踪实验

环金属化Ir(III)配合物由于具有高量子产率,大斯托克斯位移,长寿命磷光和良好的光稳定性等优异的物理和化学性质,同时作为一种优良的双光子探针,越来越受到关注。然而,由于在以往的研究中报道的Ir(III)配合物在与细胞培养系统或动物体内孵育时,具有很强的生物毒性,也不能长时间保持稳定,这限制了它们在干细胞追踪中的进一步应用。在本实验研究中,我们通过复乳法合成了Ir(MDQ)2acac纳米微球,它的外壳为聚丙烯酸和聚乙烯醇,这促进了合成的这种纳米材料的生物相容性和和化学稳定性,从而保证了我们后续实验可以顺利进行。合成这种纳米微球后,将这种纳米微球与神经干细胞共孵育一定时间,使得干细胞被这种荧光材料标记,之后将标记荧光材料的神经干细胞注射到裸鼠皮下,在不同的时间点进行小动物成像体外检测,观察荧光的位置及强度的变化,从而可以指示干细胞在体内的一个位置及存活情况。




circHIPK2促进SPIO标记神经干细胞分化及其对缺血性脑卒中的治疗作用

东南大学 姚红红 教授

(1)SPIO标记神经干细胞的细胞活性及摄取率

SPIO标记率随浓度增加而增加。在0-200ug/ml的浓度范围内,SIPO对于神经干细胞的活性无影响,在300ug/ml时,对细胞活性有显著影响。选择200ug/ml作为后续研究的浓度。

(2)SPIO标记对神经干细胞分化的影响

200ug/ml的SIPO对于神经干细胞分化没有显著影响。

(3)在神经干细胞分化过程中circHIPK2表达逐渐下调

在神经干细胞的分化过程中circHIPK2表达逐渐下调。同时转染si-circHIPK2和SPIO并没有影响干细胞的增殖。

(4)circHIPK2参与SPIO标记神经干细胞的分化过程

下调circHIPK2表达,促进神经干细胞向神经元方向分化。

(5)下调SPIO标记NSCs中circHIPK2表达促进其对缺血性脑卒中的治疗作用

对小鼠MCAO模型脑微注射转染si-circHIPK2的SIPOb标记的神经干细胞,结果发现下调circHIPK2的表达,缺血性脑卒中的脑梗死体积显著减少且促进缺血性脑卒神经功能的恢复。

(6)SPIO标记NSCs在缺血性脑卒中的示踪研究

通过MRI T2*检测(横断面和冠状面),转染circCon组和si-circHIPK2组小鼠都检测到明显的铁信号。近红外检测到脑微注射cirCon组和si-circHIPK2组小鼠神经干细胞的荧光信号。在MCAO鼠脑切片普鲁士蓝染色结果显示circCon组和si-circHIPK2组小鼠检测到明显的铁信号,以及荧光信号和铁信号的共定位。


示踪剂标记的干细胞治疗SiO2诱导肺纤维化的机制研究

新型锌指蛋白-ZC3H4参与SiO2诱导巨噬细胞活化的机制研究

东南大学巢杰 教授

构建SiO2的体外和体内刺激模型,针对SiO2导致的炎症和纤维化,初步寻找干细胞对肺泡巨噬细胞和肺内皮细胞的治疗靶标,经高通量筛选和分子生物学等手段,初步确认非编码RNA中环状RNA-circZC3H4在矽肺炎症中的作用。

二氧化硅(SiO2)粉尘进入肺泡,被肺泡巨噬细胞(AM)吞噬,发生一系列炎症反应,释放炎症因子以及纤维化因子作用于其它靶细胞,如肺成纤维细胞(PFB)会发生过度增殖和迁移,从而导致纤维化,而AM的活化在此过程中扮演了重要角色。MCPIP1是本实验室前期研究的一个靶蛋白,又名ZC3H12A,是2006年发现的一个CCCH型锌指蛋白,在巨噬细胞含量丰富的器官中表达水平较高,可能参与炎性过程与免疫反应。本课题组通过对CCCH型锌指蛋白MCPIP1的探究发现,其在SiO2刺激AM活化的过程中发挥了重要作用。ZC3H4是一种新发现的CCCH型锌指蛋白,作为MCPIP1同家族成员,其是否参与肺纤维化尚未见报道,因此本课题对ZC3H4在SiO2引起的肺泡AM的活化中的作用及其机制进行探究。

方法:利用巨噬细胞系RAW264.7建立离体SiO2刺激模型(50μg/cm2),蛋白免疫印迹(Westernblot)结合细胞的免疫荧光(Immunocytochemistry)以及免疫组织化学(Immunohistochemistry)检测AM中ZC3H4和AM活化的蛋白标志物,同时利用CRISPR/Cas9技术特异性敲减ZC3H4的表达,验证其与AM活化的关系;利用三维(3D)巢式基质模型检测ZC3H4对PFB迁移的影响。为了探究AM中ZC3H4表达的调控机制,利用q-PCR检测环状RNA-circZC3H4的水平,应用siRNA技术特异性敲除circZC3H4分析其对ZC3H4表达的调控以及对AM活化的影响。利用miR-212的拮抗物和模拟物调控miR-212的表达,结合荧光原位杂交(FISH)技术检测circZC3H4和miR-212是否有共定位,并用RNA pull-down实验检测二者是否有结合,进而对circZC3H4的调控机制进行进一步探究。同时,利用人单核细胞系U937和临床人肺泡灌洗液分离得到的肺泡AM验证上述现象。

结果:1)SiO2刺激引起AM中ZC3H4表达显著上升,并伴随AM的活化标志物显著增加;2)敲减ZC3H4显著抑制SiO2引起的上述现象;3)3D迁移实验显示, SiO2刺激的AM条件培养基引起PFB迁移增加,敲除ZC3H4显著抑制这一作用;4)SiO2刺激引起AM中circZC3H4的水平显著上升,敲除circZC3H4后能够显著抑制ZC3H4表达升高以及AM活化现象;5)miR-212参与调控ZC3H4的表达,circZC3H4通过和miR-212相互作用,以ceRNA机制参与ZC3H4表达调控;6)SiO2刺激引起U937中ZC3H4蛋白表达升高,临床人肺泡巨噬细胞样本中均观察到ZC3H4表达显著上升。

结论:AM在SiO2的刺激下,引起circZC3H4升高,继而通过结合miR-212调控ZC3H4的表达,升高的ZC3H4参与巨噬细胞活化以及下游成纤维细胞的迁移,上述通路的证实为矽肺肺纤维化的研究提供了新的思路以及潜在的诊疗靶点。



本部分研究结果已发表在FASEB J. 2018, 32(6):3264-3277.


间充质干细胞(MSCs)对SPIO的动态摄取及分泌作

南京大学侯亚义 王婷婷 教授

探讨了间充质干细胞(MSCs)对SPIO的动态摄取及分泌作用:向间充质干细胞MSCs加入200μm/mL PLL包被的SPIO,在12h,24h和48h获取细胞,采用普鲁士蓝染色,发现MSCs可大量吞噬SPIO,。接着用原子吸收分光光度法定量分析,发现在12小时,MSCs细胞吸收SPIO最多。并且24h,48h检测细胞和上清中铁的含量,发现上清中铁含量逐渐上升,细胞内显著下降。本5-实验说明MSCs吞噬并且再分泌SPIO,后续将进一步探讨免疫细胞对分泌出来的SPIO的吞噬作用。