2018年1月- 间充质和神经干细胞的体内动态示踪技术与临床转化研究

干细胞纳米示踪剂的研制

发布时间:2020-05-07发件人:消息来源:江苏省生物材料与器件重点实验室

国家重点研发计划项目“间充质和神经干细胞的体内动态示踪技术与临床转化研究”工作进展

东南大学、中科院苏州纳米所  孙剑飞、张智军


一、水冷磁致内热辅助共沉淀法制备氧化铁纳米颗粒

东南大学 孙剑飞教授


基于共沉淀原理及课题组利用磁场制备与组装磁性纳米材料的长期经验,提出水冷磁致内热辅助共沉淀法(HMIHC)的反应新策略,并以此制备出高性能的铁基纳米药物—FMT(Ferumoxytol,瑞存)。在工业制备FMT路线及检测方法的基础上,利用磁性纳米颗粒在交变磁场中因磁滞损耗和弛豫损耗可产热的特性,自主开发了一种通过磁致内热辅助化学共沉淀法制备FMT的新技术。与普通的外源加热方法相比,磁致内热极大改善了温度调控的灵敏性以及颗粒生长中的受热均匀程度,并通过辅以长时间的水冷低温循环,晶核得以规则充分的生长而具有良好的晶体性能与界面性质;在以周期性变换方向的交变磁场作用下,颗粒整体磁矩取向由无序逐渐趋向于规则的手性环形排布,磁化性能显著提升。该技术制备得到的FMT具有同类产品最强的磁响应能力。

图1. FMT制备反应过程示意图 (a)普通共沉淀法;(b) 磁致内热共沉淀法;(c)水冷磁致内热共沉淀法。



图2. 三种FMT样品的TEM、HRTEM与选区电子衍射图(a)普通水浴法制备的FMT;(b)磁致内热共沉淀制备的FMT;(c)水冷磁致内热共沉淀法制备的FMT。


进一步利用此策略开展了交变磁场结合水冷共沉淀制备极小氧化铁纳米颗粒(ESIONS)的工作。在高温的反应体系下,向极稀的铁盐溶液中缓慢加入极稀的氨水,充分混合后进行程序降温步骤,析出氧化铁沉淀用于纳米颗粒的均匀成核与生长。在制备过程中考察了起始温度及降温的影响,确定了较优的制备路线,使得最终产品有较好的形貌与MRI性能。将上述整个降温共沉淀的制备过程放在交变磁场中进行,交变磁场的响会改善颗粒的形貌、结晶度和磁响应能力,从而在MRI下有更好的TI影像对比效果。研究中还发现了一个有趣的现象,当向ESIONS终产品中加入酸/碱调节产品的pH时,减小体系的pH有更好的T1影像对比效果,增大体系的pH有更好的T2影像对比效果。这有可能在将来开发出pH值依赖的新性示踪剂。

图3.a)90℃开始降温;b)60℃开始降温;c)30℃开始降温终产品TEM粒径测量


图4.a)60℃降温,b)30℃降温,c)90℃降温制备终产品MRI效果图及弛豫率


图5.降温速率分别为a) 0.11℃/min,b)0.25℃/min ,c)0.43℃/min ,d)1.25℃/min制备TEM形貌图


图6.90℃为起点,降温速率分别为a)1.25℃/min,b)0.25℃/min,c)0.11℃/min


图7.pH分别为a)8.01,b)3.82,c)2.67,d)1.35MRI效果图和弛豫率计算


在获得ESIONS材料的基础上,我们进一步开展了干细胞标记及动物体内造影的研究,初步验证超小氧化铁纳米颗粒作为干细胞示踪剂的可行性。将ESIONS与间充质干细胞共孵育,由于其小尺寸效应、表面的正电性和良好的生物相容性可以被间充质干细胞摄取,从而达到标记干细胞的目的并可以在细胞内发挥T1造影的效果。

图8.不同铁含量ESIONs标记干细胞后的MRI表征


将不同pH的ESIONS用于SD大鼠的皮下注射与脑微注射,发现该材料可在动物体内长期稳定存在并发挥T1造影增强的效果,因为该材料的制备工艺是基于纳米颗粒药物—瑞存的路线,这表明该材料应用于干细胞示踪可能是安全并且有效的。作为一种阳性影像对比剂,将来在干细胞示踪中具有独特的优势。

图9.皮下注射不同pH的ESIONs的MRI结果,pH分别为:a)pH2.66,b)pH1.54


图10.脑微注射不同pH的ESIONs的MRI结果,pH分别为:a)空白对照;b)pH2.66;c)pH 1.54


二、Au/GdNC@SiO2干细胞示踪剂体外标记

中科院苏州纳米所张智军研究员


前期合成的Au/GdNC@SiO2对人脐带间充质干细胞(hMSCs)的标记,并考察了标记后的hMSCs 7天增殖能力评估,干细胞成骨分化能力以及成脂分化能力检测。结果发现Au/GdNC@SiO2标记后对hMSCs的增殖及成脂/成骨分化能力影响不大(图11-13),说明Au/GdNC@SiO2干细胞示踪剂具有良好的生物安全性。

11. (A) Au/GdNC@SiO2标记后的hMSCs 7天增殖实验。


对照组             电转(无示踪剂)     电转(Au/GdNC@SiO2)

12. Au/GdNC@SiO2标记后的hMSCs 22天成骨分化。





对照组             电转(无示踪剂)     电转(Au/GdNC@SiO2)

13. Au/GdNC@SiO2标记后的hMSCs 16天成脂分化。


在此基础上利用Au/GdNC@SiO2对人脐带间充质干细胞(hMSCs)标记,对标记后的hMSCs进行CT/MRI双模态成像。


CT                          

MRI                        

细胞标记量(Au原子/cell)   2.6*1073.5*109 8.7*109 1*1010 2*1010 3*1010

图14. Au/GdNC@SiO2标记的hMSCsCT/MRI双模态示踪及细胞标记浓度。


从图14可以看出,Au/GdNC@SiO2对hMSCs的标记浓度可达到3*1010Au原子/cell,这样的细胞浓度满足CT成像所需的最低浓度。标记Au/GdNC@SiO2的hMSCs具有良好的CT/MRI双模态示踪功能。