2010年11月- 生物医学纳米材料对细胞作用的研究

发布时间:2020-01-14发件人:消息来源:江苏省生物材料与器件重点实验室


国家重大科学研究计划项目“生物医学纳米材料对细胞作用的研究”工作进展与讨论

纳米颗粒对细胞内基因表达调控的作用及机制研究

东南大学 王进科 教授


本课题利用Affymetrix公司生产的全基因组表达谱芯片了检测了不同剂量的Fe3O4磁性纳米颗粒对5种不同类型的细胞全基因组基因表达调控的影响。

Fe3O4磁性纳米颗粒作用细胞后,提取总RNA样品,与全基因组表达芯片杂交并检测信号。通过与隐性对照组细胞表达谱的比较,筛选出部分差异表达的转录本(表达倍数>2 或<-2)进行进一步的分析。各处理组差异表达的转录本数目见Figure 1。

Fig.1. Numbers of differentially expressed transcripts in the five cell lines exposured to MNPs

本实验从差异表达的转录本中选取了表达量变化较为显著的H28、Slc5a3、Lcn2和Ttr 等20个基因,采用常规的实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)验证基因芯片检测结果。采用NCBI在线分析软件Primer-BLAST设计定量PCR引物,选择GAPDH为内参,通过定量PCR进行验证,结果表明定量PCR检测的基因变化趋势与芯片结果保持一致(Figure.2,Figure3)。

Fig.2 Results of qRT-PCR analysis of Lcn2 gene in Hepa1-6 cell and Id3 gene in RAW264.7 cell.

Fig.3 Confirmation of the Microarray data by qRT-PCR.

用Cluster 3.0软件对这些差异表达基因进行初步的聚类分析 (Fig.4),在聚类图中,绿色代表基因表达下调,红色代表基因表达上调。结果发现不同处理间基因表达量差异较大,提示细胞对纳米颗粒的作用后的基因表达变化具有时间和剂量依赖效应。

为了更好地揭示Fe3O4磁性纳米颗粒对细胞内基因表达调控的影响,我们对所有差异表达的基因进行了功能聚类 (Gene Ontology, GO) 和 细胞内通路分析 (KEGG pathway)。如Fig.5和Fig.6所示,纳米粒子处理细胞后,在分子水平上引发了众多基因的表达发生的变化。上调的基因主要涉及的生物学过程 (Biological processes)包括:细胞内炎症反应、免疫应答、氧化应激等;下调的基因主要与胞内生物大分子的合成与代谢、基因复制与转录调控、细胞生长、繁殖和细胞周期等相关。KEGG pathway分析结果表明,细胞内调控通路,如:Toll-like receptor signaling pathway、MAPK signaling pathway、TGF-beta signaling pathway和Wnt signaling pathway信号转导通路在细胞对纳米粒子的应答具有重要的调控作用。

本课题通过基因表达谱研究,揭示了Fe3O4磁性纳米颗粒对细胞内基因表达调控的影响。实验结果表明Fe3O4磁性纳米颗粒在基因表达的分子水平引发的综合细胞应答效应,主要包括炎症、免疫、铁离子转运与代谢、胞内大分子的合成与代谢以及细胞周期调控。这些结果为进一步阐明这种Fe3O4磁性纳米颗粒与细胞的相互作用机制提供了详尽系统的实验数据。

Fig. 4. Cluster analysis and heat map of 88 differentially expressed genes treated by different concentrations of MNPs for 4, 24 and 48 h. Red and green boxes indicate a relative up-expression or down-expression, respectively. Bars (A-D) on the left side of the figure identify the four clusters of genes with different expression after MNPs treatment.

Fig.5. Gene Ontology (GO) analysis of up-regulated transcripts in RAW264.7 cells (p≤0.05)

Fig.6. Gene Ontology (GO) analysis of down-regulated transcripts in RAW264.7 cells (p≤0.05)